プラスミド等、DNAの濃度を測定する方法として、1) 吸光度を用いる方法、2) EtBr-DNA複合体の蛍光強度を用いる方法、の二つを説明します。

1. 1)吸光度
   

　DNA溶液(TE buffer or milli Q)を希釈し、分光計で260nmと280nmの吸光度を測定します。260nmの吸光度 (A260) 1あたり、約40ng/uLとして計算します。プラスミド精製(midi prep; BioRad)の場合、A260/A280が1.7 - 2.0であれば純度的には問題ないとされています。小スケール(mini prep; BioRad)の場合、midiに比べるとA260/A280が大きくなりやすいようです。
　254号室の分光計と1mLキュベット(光路長1cm)を使う場合、原液が40ng/uL以上の濃度であれば、35 - 40倍希釈、液量700uLで測定可能です。10 - 40ng/uLも35倍希釈でおよその値はでます(吸光度で0.010くらい)が、正確な値は測定できません。

2. 2) EtBrによる蛍光測定 (96well プレート)
   
   　サンプル数が多いときや、あまりDNA溶液を無駄に使いたくないとき等に、役に立つと思います。EtBr-DNA複合体に蛍光があることを利用した方法です。蛍光分光計の方が感度は高いと思いますが、ここでは96wellプレートとプレートリーダー(Wallac1420  multilabel counter; Perkin Elmer)を用いる場合のプロトコルを説明します。
   　EtBrは、TE bufferに5ug/mLとしたものを使用します。操作は非常に簡単で、プレートに195uLのEtBr溶液を入れておき、適当に希釈したDNA溶液を5uL入れ、蛍光(Ex: 540nm, Em: 590nm)を測定するだけです。ここではプレートリーダーの設定でCW lamp energyを8000にしています。プレートリーダーには、”EtBr-DNA concentration”というプロトコル名で登録してあります。
   　この条件で濃度既知のDNA溶液を用いて測定可能な範囲を調べたところ、最終濃度で0.25ng/uLから5ng/uLは普段の実験に用いるレベルの精度では測定できます(高濃度側は5ng/uL以上は調べてません)。このデータは40倍希釈ですので、元のDNA溶液がおよそ10ng/uLから200ng/uLであれば、上のプロトコルで十分測定できるものと思われます。今回行った実験では、CW lamp energyが8000で40倍希釈で、バックグラウンド(EtBrのみ)を差し引いた蛍光強度=約1000×濃度(ng/uL)、となりましたが、ちゃんと求めるには各自検量線を引いて計算してください(96wellなのでそれほど手間はかかりません)。
   

   

   
   

　なお、液量100uL(半分)にすると蛍光強度はほぼ半分になります。

吸光度を用いた測定法では、プラスミド溶液を例えば20uLほど用いていましたが、この方法であれば5uLで済みます。

Reference

Gallagher, S. R. (1997) Quantification of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spectroscopy. Current Protocol in Immunology A.3L.1-A.3L.7